Methodenentwicklung zur Herstellung cisgener Apfelpflanzen

This thesis studies the development of methods to generate cisgenic apple plants. As classical apple breeding is a time consuming process, the concept of cisgenesis, recently presented, is a promising opportunity to develop resistant apple cultivars in a relatively short time frame. The major objectives of this study are (1) to develop a cisgenic approach via the Clean Vector Technology exploiting a heat inducible Flp/FRT recombinase system, (2) to identify a further apple specific scab resistant gene Rvi15 of GMAL 2473 to be used in transformations, and (3) to utilize the apple specific transcription factor coding gene MYB10 as a potential morphological marker. In the first two parts, the apple cultivars 'Brookfield Baigent', 'Mitchgla', 'Novajo' and 'Pinova' were genetically engineered in a cisgenic approach using the apple own scab resistance gene Rvi6 of the wild apple accession Malus floribunda No. 821. In Advance, three new methods to activate the heat inducible Flp/FRT recombinase system were tested by means of a monitoring vector, and a molecular characterisation of the system followed by analysing the expression of transferred genes. During the new methods, heat induction treatment of leaves/leaf explants was conducted at 42 °C for 4 h at 100 % humidity (method “wet chamber“), on solid media (method “plate surface”) and in liquid media (method “ddH2O”/”MSO”). Two cisgenic apple lines were generated, namely iM879-68 and iM946-193. Cisgenic line iM879-68 of the cultivar 'Pinova' was produced using the method “wet chamber” and cisgenic line iM946-193 of the cultivar 'Brookfield Baigent' was produced using the method “MSO”. Both cisgenic lines showed one T-DNA integration site. The correct excision of the recombinase cassette out of the T-DNA located in the apple genome was confirmed by sequencing. Both cisgenic lines were proofed to be resistant against Venturia inaequalis isolate 104 (race 1) in greenhouse tests and showed Rvi6 expression levels comparable to traditional bred Rvi6 harbouring cultivars. This study reports for the first time about generation of cisgenic apple plants based on a Flp/FRT recombinase system. In the third part, the candidate genes Vr2-A, Vr2-B and Vr2-C at the Rvi15 locus were investigated by PCR in selected scab resistant, respectively scab 13 Abstract susceptible descendants of a mapping population GMAL 2473 × M. ×domestica 'Golden Delicious'. Five investigated seedlings of the mapping population showed a recombination event within the Rvi15 locus. Due to the presence of the three candidate genes in all investigated resistant descendants and the absence of the three candidate genes in all investigated susceptible descendants, none of the candidate genes was identified as the resistance mediating gene. In the fourth part, the MYB10 gene of apple, exhibiting a natural allele (MYB10 (R6)) that causes a visible anthocyanin accumulation in all tissues of apple, was used. The MYB10 (R6) allele has an insertion in the promoter region of the MYB10 gene, responsible for autoinduction of the MYB10 gene expression. The incidence of the MYB10 (R6) allele was studied in genetic resources of the genus Malus. These molecular data were compared to phenotypic data for fruit flesh colour and red pigmentation. A defined promoter region of MYB10 was sequenced for numerous apple accessions and cultivars and revealed three main types of the MYB10 promoter: the most frequent MYB10 (R1) allele, the MYB10 (R6) allele and the previously unknown ~1 kb MYB10 allele. All red fleshed accessions of the Malus genebank collection carried the MYB10 (R6) allele and belong to Malus species native to Asia. A regeneration experiment with MYB10 (R6) transgenic apple lines showed a restricted usability of the MYB10 (R6) allele as a morphological marker for the cultivar 'Pinova'. Die vorliegende Dissertation behandelt die Entwicklung von Methoden zur Herstellung cisgener Apfelpflanzen. Da die klassische Apfelzüchtung ein langwieriger Prozess ist, bietet das kürzlich vorgestellte cisgenetische Konzept eine vielversprechende Möglichkeit, um resistente Apfelsorten in relativ kurzer Zeit zu produzieren. Die Hauptziele der vorliegenden Arbeit sind: (1) die Entwicklung eines cisgenetischen Ansatzes unter Verwendung eines Clean Vector Technologie Verfahrens auf Basis eines hitzeinduzierbaren Flp/FRT Rekombinasesystems; (2) die Identifizierung des Rvi15 Schorfresistenzgens von GMAL 2473, um ein weiteres apfeleigenes Resistenzgen für Transformationen verfügbar zu machen und (3) die Anwendung des apfeleigenen Transkriptionsfaktor-kodierenden Gens MYB10 als potentiellen morphologischen Marker. Im den ersten beiden Teilen der Arbeit wurden die Apfelsorten 'Brookfield Baigent', 'Mitchgla', 'Novajo' und 'Pinova' durch einen cisgenetischen Ansatz gentechnisch verändert. Dabei wurde das apfeleigene Schorfresistenzgens Rvi6 aus der Wildapfelakzession Malus floribunda No. 821 in diese Sorten übertragen. Durch die Anwendung eines Monitoringvektors konnten im Vorfeld drei neue Methoden zur Aktivierung des hitzeinduzierbaren Flp/FRT Rekombinasesystems etabliert und das System durch Expressionsanalysen molekular genauer charakterisiert werden. Bei den neuen Methoden erfolgte die Hitzebehandlung von Blättern bzw. Blattexplantaten bei 42 °C für 4 h bei 100 % Luftfeuchte (Methode „Feuchtekammer“), auf festem Nährmedium (Methode „Mediumplatte“) bzw. in Flüssigkeitkeit (Methode „ddH2O“/„MSO“). Zwei cisgene Apfellinien, iM879-68 und iM946-193, wurden erzeugt. Die cisgene Linie iM879-68 der Sorte 'Pinova' wurde mit Methode „Feuchtekammer“ und die cisgene Linie iM946-193 der Sorte 'Brookfield Baigent' mit der Methode „MSO“ generiert. Beide cisgene Linien zeigten einen einzelnen T-DNA-Integrationsort. Das präzise Ausschneiden der Rekombinasekassette aus der im Apfelgenom integrierten T-DNA wurde per Sequenzierung belegt. Beide cisgene Linien besaßen eine verbesserte Schorfresistenz gegenüber dem Venturia inaequalis Isolat 104 (Rasse 1) im Gewächshaus und zeigten ein vergleichbares Rvi6 mRNA-Expressionlevel zu traditionell gezüchteten Rvi6 tragenden Sorten. Die vorliegende Arbeit belegt die erstmalige Produktion cisgener Apfelpflanzen über Anwendung des Flp/FRT Rekombinasesystems. Im dritten Teil der Arbeit wurde die Präsenz der drei Schorfresistenzkandidatengene Vr2-A, Vr2-B und Vr2-C des Rvi15 Locus in gewählten schorfresistenten und schorfanfälligen Nachkommen einer Kartierungspopulation GMAL 2473 × M. ×domestica 'Golden Delicious' durch einem PCR-basierten Ansatz untersucht. Fünf analysierte Sämlinge der Kartierungspopulation zeigten eine Rekombination innerhalb des Rvi15 Locus. Da in allen begutachteten schorfresistenten und schorfanfälligen Nachkommen die drei Schorfresistenzkandidatengene anwesend bzw. abwesend waren, konnte keines der drei Kandidatengene als Schorfresistenz vermittelndes Gen identifiziert werden. Der vierte Teil der Arbeit fokussierte das apfeleigene MYB10 Gen, von dem ein natürliches Allel (MYB10 (R6)) eine sichtbare Anthocyananreicherung in allen Geweben des Apfels verursacht. Das MYB10 (R6) Allel weist eine Insertion im Promotor des MYB10 Gens auf, ursächlich für die Autoinduktion der MYB10 Genexpression. Das Vorkommen des MYB10 (R6) Allels wurde in genetischen Ressourcen des Apfels artübergreifend untersucht. Diese molekularen Daten wurden mit phänotypischen Daten zur Fruchtfleischfarbe und roter Pigmentierung abgeglichen. Für eine Vielzahl von Akzessionen und Sorten wurde ein definierter Abschnitt des MYB10 Promotors sequenziert und offenbarte drei verschiedene MYB10 Promotorhaupttypen: das am häufigsten vorkommende MYB10 (R1) Allel, das MYB10 (R6) Allel und das bisher unbekannte ~1 kb MYB10 Allel. Alle rotfleischigen Akzessionen der Malus Sammlung der Obstgenbank Dresden besaßen das MYB10 (R6) Promotorallel und sind Apfelarten zugeordnet, die ursprünglich in Asien beheimatet waren. Ein Regenerationsversuch mit MYB10 (R6) transgenen Apfellinien zeigte eine eingeschränkte Verwendbarkeit des MYB10 (R6) Allels als morphologischen Marker für die Sorte 'Pinova'.